一、简并引物 设计软件
简并引物设计的方法
简并引物是指用来编码一段短肽序列的不同碱基序列的混合物。主要用来同源克隆未知的基因，或用来分析某一种基因多态性的一种方法。简并引物设计的常见程序如下：1.利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列。
因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。
2.对所找到的序列进行多序列比对。
将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，最好采用局部比对程序如BLOCK，网址：... ww/make_blocks.html。也可选工具有Clustal W。
3.确定合适的保守区域。
设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～400个氨基酸为宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有4个氨基酸。若比对结果保守性不是很强很可能找不到4个氨基酸的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。最终目的就是至少有两个4个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。
4.利用软件设计引物。
当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，如利用primer 5.0进行设计。但最好使用专门的简并引物设计的方法如：CODEHOP（网址：），GeneFisher2（网址：）。
在这里我们特别值得说明的是CODEHOP方法，该方法要求的保守区较短，而且能有效的降低引物的兼并度，是一种非常有效的方法。该方法主要是通过将简并区放在3′末端，并在5′端设计一个一致性的区域来降低兼并度，详见。
5.对引物的修饰
若得到的引物为：5-NAGSGNGCDTTANCABK-3，则其简并度＝4×2×4×3×4×3×2=2304，很明显该条引物的简并度太高不利于 pcr。我们可以通过用次黄嘌呤代替N（因为次黄嘌呤能很好的和4种碱基配对）和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度（有个查密码子偏好的数据库网址：... ht=%C3%DC%C2%EB%D7% D3）。
注意：该方法设计出来简并引物对，适用于用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种。
引物中符号说明：
A代表A
C代表C
G代表 G
T代表T
M代表A or C
R代表A or G
W代表 A or T
S代表 C or G
Y代表 C or T
K代表 G or T
V代表A or C or G
H代表A or C or T
D代表 A or G or T
B代表C or G or T
N代表 G or A or T or C
二、引物设计的、软件有哪些有什么优点和缺点
引物设计相关软件！
NoePrimer 2.03独特的引物设计软件
Primer Premier 6.0 DEMO序列分析与引物设计，非常棒的一个软件。
Oligo 7.36 Demo引物设计分析著名软件，主要应用于核酸序列引物分析设计软件。
Primer D'Signer 1.1免费的引物设计辅助软件，专门用于pASK-IBA和pPR-IBA表达载体，简化引物设计工作。
Array Designer 4.25 Demo DNA微阵列（microarray）软件，批量设计DNA和寡核苷酸引物工具。
Beacon Designer 7.80 Demo实时荧光定量PCR分子信标(Molecular beacon)及TaqMan探针设计软件。
NetPrimer JAVA语言写成的免费引物设计软件，用IE打开运行。
TGGE-STAR DOS软件，PCR结合梯度凝胶电泳实验引物设计软件。
e-PCR 2.3.9电子克隆是一种电脑软件，用来识别DNA序列标签位点（STSs)。
FastPCR 6.0.165b2快速设计各种类型PCR引物，还包括一些常用的DNA与蛋白序列软件工具；
OligoMaster 1.0.164多用户寡核苷酸管理软件，可建立寡核苷酸数据库
PerlPrimer v1.1.19一个免费的用来设计引物的开源软件。
AmplifX 1.5.4设计与管理引物的软件。
AutoDimer 1.0快速筛选二聚体引物软件。
MutaPrimer 1.00用于定点突变的引物设计桌面工具软件
ORFprimer 1.6.4.1 JAVA语言设计的引物设计软件
Primer Prim'er 5.6.0 Flash制作的PCR引物设计软件。
PCR Analyzer 1.0实时RT-PCR反应中估算初始扩增子浓度软件
在线工具
DNAWorks 3.0是一个帮助进行基因合成的设计寡核苷酸序列的免费程序。程序仅需要输入一些简单的信息，比如，目标蛋白的氨基酸序列及合成核酸序列的温度。程序输出的为适合所选择生物表达的优化密码子的核酸序列。利用DNAWorks的帮助，用两步PCR法，可以成功合成长度达到3000碱基对的基因。原始网站。
The Primer Generator在线引物设计程序。
Primer 3比较有名的在线引物设计程序。
Primo Pro 3.4在线PCR引物设计java系列软件。
Web Primer斯坦福大学提供的在线引物设计软件。
AutoPrime快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件.
一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。
附上两款软件使用方法！
Primer Premier 5.0的使用技巧简介
1.功能
“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计()、限制性内切酶位点分析()和DNA基元(motif)查找()。“Premier”还具有同源性分析功能（），但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA与蛋白序列的互换（）、语音提示键盘输入（）等等。
有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA来设计引物，由于大多数氨基酸（20种常见结构氨基酸中的18种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA的来源以相应的遗传密码规则转换DNA和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。
2.使用步骤及技巧
“Premier”软件启动界面如下：
(转载的时候就没有图)
其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10序列，-35序列等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。
进行引物设计时，点击按钮，界面如下：
进一步点击按钮，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目的（Seach For）有三种选项，PCR引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交****（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然
后按，随之出现的Search Progress窗口中显示Search Completed时，再按，这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为100，即各指标基本都能达标（如下图）。
点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier”主窗口，如图所示：
该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。
在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，可点击，然后修改引物序列。若要回到搜索结果中，则点击按钮。如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则，反推至DNA序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易使用，是一个相当不错的软件。
Oligo 6.22使用技巧简介
1.功能
在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0的初始界面是两个图：Tm图和ΔG图；Oligo 6.22的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。
2.使用（以Oligo 6.22为例）
Oligo 6.22的启动界面如下：
图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq，其中Frq是6.22版本的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为tili方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo5.0，只是显示更清楚了。
经过Windows/Tili项后的显示如图：
在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左下角的Upper按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。∆G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的∆G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：）
Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3’端Frq值相对较低的片段。
当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。
当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR的模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site的检测。这项检查
可以看出引物在非目的位点引发PCR反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的PCR结果。一般在错配引发效率以不超过100为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。当我们结束以上四项检测，按Alt+P键弹出PCR窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。
由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。
除了本地引物设计软件之外，现在还有一些网上引物设计软件，如由Whitehead Institute开发的“Primer 3”等（本网站已引进并调试好该软件，欢迎使用）。该软件的独特之处在于，对全基因组PCR的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对，发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR的用户试用。
三、引物常用引物设计软件
引物设计软件在科学研究中扮演着重要角色，其中两款广受欢迎的引物设计软件分别是Oligo 6和Primer Premier 5.0。这两款软件不仅能够简化引物和探针的设计过程，还提供了许多高级功能，以满足科研人员的多样化需求。以下是对这两款软件的详细介绍：
Oligo 6是目前使用最为广泛的一款引物设计软件。其高级功能包括但不限于：
已知一个PCR引物的序列后，Oligo 6能搜寻和设计与之相匹配的另一个引物序列；
根据不同的物种对MM子的偏好性，设计简并引物；
为环型DNA片段设计反向PCR引物；
设计多重PCR引物；
为LCR反应设计探针，用于检测特定突变的存在；
分析和评估其他设计方法的引物合理性；
利用同源序列查找功能，根据同源区设计引物；
增强的引物/探针搜索手段，允许用户锁定特定参数，如Tm值范围和引物3’端的稳定性等；
以多种格式存储设计结果，支持多用户环境，每个用户可以保存个性化的设置。
Primer Premier 5.0是另一种功能强大的引物设计软件。它通过高级引物搜索、巢式引物设计、引物编辑和分析等功能，帮助研究人员设计出高效扩增能力的理想引物，甚至用于扩增长达50kb的PCR产物。该软件主要由以下几个功能板块组成：
GeneTank序列编辑：用于编辑和修改DNA/RNA序列；
Primer引物设计：提供高效、精确的引物设计功能；
Align序列比较：比较不同序列间的相似性和差异性；
Enzyme酶切分析：分析酶切位点和酶切效率；
Motif基序分析：识别和分析序列中的特定基序或模式。
综上所述，Oligo 6和Primer Premier 5.0这两款引物设计软件均具有强大的功能，能够满足科研人员在引物设计过程中的多样化需求。它们的高级功能和用户友好的界面使得引物设计变得更加简单、高效，从而促进科学研究的进展。
扩展资料
引物（primer），是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。